400-0588-268

相互作用蛋白质组学

  相互作用蛋白质组学(interaction proteomics)是一种基于质谱技术对蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、蛋白质-药物/小分子化合物的相互作用进行大规模定性或定量研究的蛋白质组学方法。采用免疫沉淀(IP)或pull down等亲和分离手段,将能够与特定分子结合的蛋白质复合物进行分离,然后利用蛋白质组学大规模定性或定量的优势进行蛋白质复合物解析,是研究蛋白质与生物分子或药物之间相互作用的强大工具。

  传统的蛋白质相互作用研究方法需要研究者根据已有研究基础和较深入的研究背景,通过一定的摸索或积累,对可能存在的相互作用进行准确地预测,然后对预测的相互作用进行验证;并且其通量小、研究效率低、获得的信息量有限。相比于传统蛋白质相互作用研究方法,基于质谱技术的相互作用蛋白质组学的大规模研究模式所具有的优点包括:

  1. 大规模的开放性研究,可更为高效地发掘和鉴定相互作用蛋白质;

  2. 信息输出规模大,能够在网络层面上全面地描绘和反映蛋白质相互作用关系;

  3. 开放性研究和大规模信息,可能带来更为创新的发现 ;

  利用定性蛋白质组学的方法对IP或pull down分离出的蛋白复合物的组成进行鉴定分析,已成为大规模研究蛋白质相互作用关系的主流方法。然而,很多情况下,蛋白质与蛋白质之间的相互作用,并不是non-all的形式;对蛋白质的相互作用进行量化,也能够更为准确地反映蛋白质的相互作用关系和动态改变。因此,在大规模定性研究的基础上,通过结合大发老虎机学的Label free或SILAC的方法,还可以实现对大规模蛋白质相互作用的定量分析,进而阐明特定条件下生物体内蛋白相互作用的动态变化。

  本公司采用Thermo Scientific的LTQ-Velos或Q-Exactive质谱仪对亲和分离的蛋白质复合物进行鉴定分析,采用高分辨率质谱 Q-Exactive质谱仪(Thermo Scientific)或Triple TOFTM 5600质谱仪(AB SCIEX),对亲和分离的蛋白进行Label free或SILAC定量分析。

  ◆ 主要应用范围

  利用IP或pull down等亲和实验手段,研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、蛋白质-小分子化合物相互作用;

  1. 揭示目标蛋白质的作用机制及调控方式:阐明目标蛋白质所参与的功能复合物的组成、上下游信号通路的构成;寻找与目标蛋白质作用直接相关的酶或其作用的底物等;

  2. 免疫识别及机制研究:寻找自身抗体对应的抗原;寻找病原体识别有关的宿主免疫系统相关蛋白质等;

  3. 表观调控研究:寻找目标DNA转录相关调控因子;寻找RNA的翻译调控相关蛋白质,或与LncRNA作用相关的蛋白质等;

  4. 药物作用与机制研究:揭示药物/活性小分子的直接作用靶点;激酶抑制剂的激酶靶点鉴定及作用选择性评价等。

  ◆ 技术路线

  ◆ 样本来源与要求

  如技术路线所示,客户自行进行IP或pull down实验,根据实验目的选择以下方式(选其一)将样品送至本公司,进行后续蛋白质组学分析:

  送样形式1——蛋白质凝胶条带的定性分析:洗脱下来的蛋白质溶液,经SDS-PAGE电泳后,将仅在实验组中显著表达,而在对照组中无明显表达的蛋白质条带进行切取后送样。条带样品进行胶内酶解后,进行LC-MS/MS定性分析。此方法可有针对性地进行目的条带的鉴定,并可有效排除高丰度蛋白质对质谱鉴定的干扰。

  送样形式2——定量分析:洗脱下来的蛋白质溶液。溶液样品进行溶液内酶解后,进行LC-MS/MS定量分析。相比于胶内酶解的方式,复杂样品进行溶液内酶解的酶解效率会更高、组间平行性更好。需要注意的是:对于IP实验,通常洗脱下来的蛋白质溶液中可能会存在高丰度的抗体,高丰度蛋白质的存在会降低质谱对低丰度蛋白质的检测效率。而利用抗体共价交联的基质进行的IP,或His-、GST-、Biotin-等标签进行的pull down实验,此类方法洗脱下的样品中一般不存在高丰度抗体干扰问题,质谱的检测效率较高。因此,对于相互作用的定量分析,建议客户尽量采用交联抗体进行IP实验或pull down法进行亲和实验,将会有利于在后期分析过程中提高质谱检测的效率。

  样本量要求:

  洗脱的溶液样品:蛋白质总量>50?g;

  SDS-PAGE胶条带:明显可见的考染条带或者质谱兼容银染条带。

  ◆ 定量相互作用蛋白质组学的方法选择与实验设计要求

  在相互作用定性研究的基础上,还可对蛋白质相互作用进行定量分析。对蛋白质相互作用进行的定量分析通常采用Label free或SILAC的相对大发老虎机学方法。两种方法优缺点以及技术流程如下:

  1. Label free: 非标记的定量方法。将不同组样本分别进行亲和实验及液质联用(LC-MS/MS)分析,然后将数据进行整合定量比较。该方法对蛋白质样品需求量少,具有较广的分析范围和高灵敏度,对IP或者pull down上游实验设计的样品来源无特定要求,可以是细胞,微生物,动植物组织等。但定量结果的准确性依赖于实验操作的平行性和质谱重复实验设计。

  2. SILAC:代谢型的标记定量方法。将不同组细胞样品在传代培养过程中进行不同的稳定同位素氨基酸标记,标记完成的不同组样品进行样本制备后即可进行混合,然后将混合样进行后续的亲和实验和质谱分析。因此,SILAC能最大程度地保证样本处理、亲和实验操作和质谱分析的平行性,其具有非常好的定量准确性和重复性。但代谢型的标记方法的样本类型有限(通常为可传代培养的细胞样品),经济耗费也较大。

  推荐的实验重复的设计:

  Label free分析:独立的亲和实验重复次数n≥3;

  SILAC分析:生物学重复实验次数n≥2(推荐正反标记重复实验);

  ◆ 后续生物信息学分析(可选)

  生物信息学分析能够对蛋白质的相互作用网络、蛋白质功能、蛋白质参与的信号通路等进行全面地注释及分析,帮助我们系统地了解蛋白质的网络构成和相互关系,及有效地进行数据挖掘和分析,为后续的实验提供依据和线索。主要分析内容包括:

  1. 蛋白质相互作用网络分析:通过查询蛋白质相互作用数据库(如:IntAct,MINT,DIP等)和相关文献,确定鉴定到的蛋白质或差异表达蛋白质之间的相互作用,以及找到与之能够发生直接作用的其他蛋白质;

  2. GO功能注释:对鉴定到的相互作用蛋白质或挑选出的差异表达蛋白质的分子功能、参与的生物过程及其在细胞组份中的分布进行注释。

  3. KEGG通路注释:对鉴定到的相互作用蛋白质或挑选出的差异表达蛋白质进行KEGG通路注释,分析并确定蛋白质参与的最主要的信号转导通路或代谢途径。

  4. 富集分析:以所有鉴定到的蛋白质为背景,通过Fisher精确检验,找出显著富集的GO功能条目或通路,从而得知生物学处理对哪些功能、生物学过程或信号通路、代谢通路有显著影响。

  参考文献

  1. Kaake, R. M., Wang, X., and Huang, L. (2010) Profiling of protein interaction networks of protein complexes using affinity purification and quantitative mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics : MCP 9, 1650-1665

  2. Sharma, K., Weber, C., Bairlein, M., Greff, Z., Keri, G., Cox, J., Olsen, J. V., and Daub, H. (2009) Proteomics strategy for quantitative